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微生物部 ウイルス検査

更新日:2008年12月26日 青森県環境保健センター

1.1-(1) 組織培養によるウイルス分離

ア. 組織培養
組織培養
 ウイルスは、生きている細胞の中でのみ増殖するため、選択的かつ効率的に増殖できるように、当所では主に、Vero細胞(アフリカミドリザル腎)、Hela細胞(ヒト子宮頚部上皮癌)、RD細胞(ヒト胎児性横紋筋肉腫)、MDCK細胞(イヌ腎)、GMK細胞(アフリカミドリザル腎)等の数種類の培養細胞を組み合わせて使用しいます。これらの細胞は常時使用するため、37℃孵卵器内で維持培養しています。
イ. 検体の前処理
検体の写真
 検体は、様々な形態があり、各検査を実施するのにそのままでは使用できません。特に、糞便は、検査に悪影響を及ぼす多くの細菌類や固形物が含まれていることもあって、前処理が欠かせません。検体の種類により異なりますが、高速遠心機による固形物の除去や、抗生剤による除菌処理を行います。

(←写真)左から髄液、咽頭ぬぐい液、血液、糞便です。
ウ. 検体の接種・吸着
 前処理した検体は、通常、Vero、Hela、RDの3つの細胞に接種します。細胞への感受性により、特に、インフルエンザウイルスの場合はMDCK細胞に接種します。そして、35℃孵卵器内で1時間ほど静置します(吸着)。検体中にウイルスが存在すると、この間に各細胞内にウイルスが侵入します。
エ. 回転培養
回転培養
 吸着が終了したら、細胞維持液を添加して、さらに35℃孵卵器内で今度は回転させながら培養します。この間、ウイルスは、細胞内で増殖した後、細胞の外側へ出てきて、また別の細胞へと侵入し、増殖を繰り返します。
オ. 顕微鏡観察
 以後、毎日、顕微鏡による細胞の状態の観察を行います。検体中にウイルスが存在すると、含まれるウイルス量によっても異なりますが、通常2~7日程度で細胞が変性(細胞変性効果cytopathic effect;CPE)してきます。CPEは、培養細胞が顆粒状や円形化、膨化などいろいろな形態を示し、最後には培養容器から脱落して細胞維持液中を浮遊するため、顕微鏡での確認がしやすくなります。また、CPEはウイルスによって特徴的であるため、それらの違いでウイルスの種類をある程度推測することができます。
 2~7日でCPEが見られない場合は、細胞維持液(培養細胞含む。)の-80℃凍結融解を繰り返し、その一部を新たな培養細胞に接種し、さらに2~7日間顕微鏡による観察を続けます。(継代)

  • GMK細胞
    GMK細胞(正常)
  • エンテロウイルス(Echo9)によるCPE
    エンテロウイルス(Echo9)によるCPE
カ. ウイルス同定
 ウイルスによるCPEが観察された検体については、中和試験やHI試験等による同定を行います。
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